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형질전환 실험
| 자료번호 | p627622 | ||
|---|---|---|---|
| 수정일 | 2010.06.07 | 등록일 | 2009.10.30 |
| 페이지수 | 5Page | 파일형식 |  한글(hwp) |
| 판매자 | db***** | 가격 | 3,000원 |
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소개글
형질전환 실험 자료입니다.
목차
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본문내용
전체적인 cloning 과정을 살펴보면 먼저 insert를 PCR시킨 뒤에 NdeⅠ, XhoⅠ으로 자르고, 또한 vector인 pET23을 NdeⅠ과 XhoⅠ으로 자른다. 그 뒤 이 둘을 ligation 시키고 E.coli competent cell의 plasmid를 이용해 transformation 과정을 거친 뒤에 제대로 들어갔는지 확인하면 된다.
2. PROCEDURE & RESULTS
<primer stock의 dilution>
먼저 210bp를 PCR할 때 쓸 primer F와 R을 100μM stock으로 만든 다음에 새 tube에 1/5로 dilution 한다. (DDW 80㎕에 primer stock 20㎕를 넣는다.)
annealing할 때 시간은 1Kb당 1분으로 계산하고 온도는 G≡C 4℃, A=T 2℃으로 계산하면 된다. 따라서 primer의 서열이 ACGTTAG라면 2 + 4 + 4 + 2 + 2 + 2 + 4 = 20℃가 annealing 의 온도가 된다.
<agarose gel을 통한 size 확인>
PCR이 끝난 뒤에 agarose gel에 100V에서 20분 전기영동 시킨다.
agarose gel을 만드는 방법은 먼저 TBE buffer 2.5X를 0.5X로 dilution 한다. (TBE buffer 20ml + DDW 80ml)
여기서 20ml를 버리고 80ml를 agarose 0.8g을 넣어서(1%) 전자레인지에 3분 정도 돌린다. 여기에 EtBr을 1λ만큼 넣어서 작은 agarose gel과 큰 agarose gel(2 well)에 각각 10ml 60ml 정도 나누어 부어 굳힌다. EtBr은 DNA 사이사이에 끼어들어가 DNA가 어느 위치에 있는지 알 수 있게 해준다.
먼저 작은 agarose gel에 buffer를 gel이 다 잠기도록 넣은 후 size가 맞는지 확인하기 위해서 Gel에 걸때 marker(100bp)와 PCR Sample(50㎕) + 6X loading buffer 10㎕를 pipetting해서 7λ를 loading 한 후 20분 정도 전기영동하고 band가 반쯤까지 내려와 있으면 마친다. 그 다음 gel을 UV로 확인한다.
2. PROCEDURE & RESULTS
<primer stock의 dilution>
먼저 210bp를 PCR할 때 쓸 primer F와 R을 100μM stock으로 만든 다음에 새 tube에 1/5로 dilution 한다. (DDW 80㎕에 primer stock 20㎕를 넣는다.)
annealing할 때 시간은 1Kb당 1분으로 계산하고 온도는 G≡C 4℃, A=T 2℃으로 계산하면 된다. 따라서 primer의 서열이 ACGTTAG라면 2 + 4 + 4 + 2 + 2 + 2 + 4 = 20℃가 annealing 의 온도가 된다.
<agarose gel을 통한 size 확인>
PCR이 끝난 뒤에 agarose gel에 100V에서 20분 전기영동 시킨다.
agarose gel을 만드는 방법은 먼저 TBE buffer 2.5X를 0.5X로 dilution 한다. (TBE buffer 20ml + DDW 80ml)
여기서 20ml를 버리고 80ml를 agarose 0.8g을 넣어서(1%) 전자레인지에 3분 정도 돌린다. 여기에 EtBr을 1λ만큼 넣어서 작은 agarose gel과 큰 agarose gel(2 well)에 각각 10ml 60ml 정도 나누어 부어 굳힌다. EtBr은 DNA 사이사이에 끼어들어가 DNA가 어느 위치에 있는지 알 수 있게 해준다.
먼저 작은 agarose gel에 buffer를 gel이 다 잠기도록 넣은 후 size가 맞는지 확인하기 위해서 Gel에 걸때 marker(100bp)와 PCR Sample(50㎕) + 6X loading buffer 10㎕를 pipetting해서 7λ를 loading 한 후 20분 정도 전기영동하고 band가 반쯤까지 내려와 있으면 마친다. 그 다음 gel을 UV로 확인한다.
참고문헌
1) Gene cloning and DNA analysis An Introduction, T.A.Brown, Fourth Edition
2) Size marker
http://images.google.co.kr/imgres?imgurl=http://www.bioneer.co.kr/upimage/product/pro57840p111-02.jpg&imgrefurl=http://www.bioneer.co.kr/product/product_desc.jsp%3FtopPClassCode%3D681%26pclassCode%3D696&h=413&w=180&sz=16&hl=ko&start=2&tbnid=Sdb1v6W41d_PLM:&tbnh=125&tbnw=54&prev=/images%3Fq%3Dsize%2Bmarker%2B100bp%26svnum%3D10%26hl%3Dko%26lr%3D%26newwindow%3D1%26sa%3DN
3) pET 23c vector
http://www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB051.pdf
2) Size marker
http://images.google.co.kr/imgres?imgurl=http://www.bioneer.co.kr/upimage/product/pro57840p111-02.jpg&imgrefurl=http://www.bioneer.co.kr/product/product_desc.jsp%3FtopPClassCode%3D681%26pclassCode%3D696&h=413&w=180&sz=16&hl=ko&start=2&tbnid=Sdb1v6W41d_PLM:&tbnh=125&tbnw=54&prev=/images%3Fq%3Dsize%2Bmarker%2B100bp%26svnum%3D10%26hl%3Dko%26lr%3D%26newwindow%3D1%26sa%3DN
3) pET 23c vector
http://www.merckbiosciences.com/docs/docs/PROT/TB051.pdf
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